Protocolos:

Protocolos para colocar trampas de Malaise y manipular las muestras

Protocolos para Culicidae (Darlene Judd)

Protocolos para Ceratopogonidae (Art Borkent)

Protocolos para Dolichopodidae (Daniel Bickel)

Protocolos para Asilidae (Eric Fisher)

Protocolos para Sarcophagidae (Thomas Pape)

Protocolo para separar Acalyptratae (Stephen Marshall y Matthias Buck)



Protocolos para Ceratopogonidae (Art Borkent)

Procedimiento para preparar láminas fijas de Ceratopogonidae (Por Art Borkent)

El siguiente procedimiento es apropiado para especímenes preservados en alcohol etílico y que no hayan estado guardados por largos períodos (2-3 años ó hasta 7-10 años si han estado guardados en un sitio frío y oscuro).

Para iniciar la preparación de las láminas fijas se deben poner las siguientes soluciones en una serie de "recipientes de Stender" ("Stender dishes") como se muestra en la figura 1: ácido acético al 15%, 2-propanol, 2-propanol sobre aceite de clavo, aceite de clavo (cada recipiente lleno hasta 3/4 partes). Cada espécimen debe pasar por toda esta secuencia de soluciones químicas. Todos los recipientes se deben colocar en una tabla delgada de manera que puedan moverse juntos sobre la mesa de trabajo; esto facilita el mirar a los especímenes mientras están en las soluciones e, incluso, ponerlos en un lugar seguro mientras están en remojo.

Es necesario tener lista una serie de portaobjetos, los cuales deben limpiarse bien con papel toalla o con una tela apropiada; es indispensable identificar cada uno con una etiqueta en blanco y colocarlos en una bandeja. Para los primeros cinco portaobjetos se escribirá el número de localidad y de espécimen de manera que correspondan con los primeros cinco en preparación.


Preparando Láminas fijas

Los pasos por seguir son los siguientes:

1. Coloque el espécimen en un recipiente con alcohol etílico bajo el microscopio. Remueva las alas; para ello tómelas desde la base y hale con las pinzas hacia afuera. Coloque ambas alas en el recipiente con ácido acético al 15%.

2. Para la mayoría de los especímenes, separe la cabeza y el abdomen del tórax. Para especímenes muy pequeños, simplemente estire la membrana entre cabeza y tórax y entre abdomen y tórax, de tal forma que todas las partes se mantengan unidas unas a otras. Coloque las partes o el espécimen estirado en un vial de 3 "dram" con 1/4 a 1/3 de KOH al 8%. Prepare, de esta manera, un total de 5 especímenes. Cada vial debe ser numerado con un lápiz de cera ("grease pencil") para que pueda ser asociado con las alas colocadas en el ácido acético.

3. Coloque los viales con KOH en una cubeta ("beaker") parcialmente llena con agua. Esta se pone a calentar hasta que el agua hierva. Los especímenes se van a volver más claros (los músculos van a desaparecer) después de 2-5 minutos, dependiendo de su tamaño. Es importante que los especímenes de tamaño similar se "cocinen" al mismo tiempo, para que todos se aclaren en un mismo momento.

4. El siguiente paso es importante que se efectúe con cierta rapidez ya que los especímenes se dañan si permanecen en KOH por mucho tiempo. Para evitar que esto ocurra, saque el espécimen del vial y póngalo en un plato con algo de KOH 8% y ubíquelo bajo el microscopio para observar si se ha aclarado apropiadamente. Los músculos deberían haberse disuelto y fluir libremente fuera del cuerpo si éste se presiona; esto debe realizarse muy, pero muy suavemente con las pinzas (utilice este método sólo hasta que se haya familiarizado con qué es lo que hay que mirar. También, si los especímenes se han aclarado demasiado, la lámina resultante será de mala calidad. Si el aclarado es suficiente, ponga el espécimen en ácido acético con las alas asociadas y déjelo allí por 15 minutos o más si es necesario.

5. Pase el espécimen a 2-propanol al menos por 15 minutos (si se deja por más tiempo no es problema).

6. Pase el espécimen a 2-propanol sobre aceite de clavo. Déjelo hasta que se sumerja hasta el fondo del plato, lo que, generalmente, tarda entre 20 ó 60 minutos, dependiendo de su tamaño; se puede dejar más tiempo si es necesario. Luego de uno o dos días, el 2-propanol se mezclará con el aceite de clavo y, entonces, se deberá agregar más 2-propanol para que siempre haya una capa distintiva entre el 2-propanol y el aceite de clavo. Si la mezcla tiene demasiado 2-propanol, la mezcla se puede dejar destapada unas pocas horas para que el exceso se evapore.

7. Pase el espécimen a aceite de clavo puro y déjelo por lo menos 30 minutos (si se deja más tiempo no es problema).

8. Ponga una pequeña gota de Bálsamo de Canadá sobre el portaobjetos y coloque las alas en la gota. Acomódelas como en la Figura 2. Coloque el cubreobjeto sobre las alas. Si el Bálsamo de Canadá ya se ha endurecido demasiado, como para mover las alas fácilmente, agregue una pequeña gota de xyleno, el cual hace que el Bálsamo de Canadá sea más fluido. Use también xyleno para los siguientes pasos dado que siempre se necesita porque el Bálsamo de Canadá se seca más rápidamente que el tiempo que toma preparar una buena lámina fija.

9. Ponga pequeñas gotas de Bálsamo de Canadá sobre el portaobjetos y coloque la cabeza, tórax y abdomen según las posiciones de la Figura 2. Si estas partes del cuerpo aún están parcialmente unidas (especímenes pequeños) coloque el espécimen en la gota que iría a contener sólo el tórax y remueva la cabeza y abdomen; ubique estas últimas en lugares apropiados.

10. Remueva las patas derechas y las antenas y deposítelas en el sitio mostrado en la Figura 2; coloque un cubreobjetos sobre las patas y las antenas.

11. Arregle el tórax de manera que el lado izquierdo quede hacia arriba como en Figura 2. Haga lo mismo para la cabeza.

12. Este paso es muy importante ya que los detalles de los genitales son, a menudo, muy importantes para la identificación de especies. Arregle el abdomen de manera que la parte ventral de los genitales quede hacia arriba como se muestra en Figura 3. En algunos machos, los genitales pueden estar solamente parcialmente girados en relación con el resto del abdomen y, en estos casos, a veces es necesario removerlos rompiendo la membrana con las pinzas y con la ayuda de un alfiler, de manera que los genitales queden con la parte ventral hacia arriba. La posición del resto del abdomen no es importante. Ponga suficiente cantidad de Bálsamo de Canadá sobre los genitales y con cuidado ponga un cubreobjetos sobre el abdomen. Presione alrededor del cubreobjetos para asegurarse que los genitales queden en posición correcta.

13. Coloque la lámina fija en el horno de secado. Luego de 1 ó 2 días, el Bálsamo de Canadá, con la cabeza, abdomen y tórax, estará algo seco. Agregue, entonces, un poco más de Bálsamo a cada una de estas partes y, con mucho cuidado, colóqueles un cubreobjetos, de manera que no se dañen. El Bálsamo parcialmente seco debería proteger dichas partes. Mientras la lámina se está secando, el Bálsamo podría dejar una pequeña burbuja de aire bajo el cubreobjeto; si esto ocurriera, agregue una cantidad muy pequeña del Bálsamo. No se preocupe si el Bálsamo agregado atrapa una burbuja de aire bajo el cubreobjetos; la burbuja, después de un tiempo, tiende a salir por sí sola.

14 Coloque de nuevo la lámina en el horno de secado. Revise las burbujas de aire durante los próximos días y agregue el Bálsamo si es necesario (de nuevo, no se preocupe por las burbujas). Remueva la lámina aproximadamente después de una semana y colóquela en la caja portaláminas. Mantenga la caja en posición vertical, para que las láminas permanezcan en posición horizontal.

Se pueden preparar grupos de 5 especímenes a la vez (disección, KOH, ácido acético). Después de que todos estén en 2-propanol, se puede iniciar la preparación de otro grupo de manera que varias series de 5 especímenes pueden estar en proceso al mismo tiempo, a saber: un grupo de cinco siguiendo al grupo de cinco previo

 

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